Gaskromatografi-massespektrometri

Historie

De første forskningsartikler om gas-væske-kromatografi blev offentliggjort i 1950. Kemikere brugte forskellige detektorer til at se, at forbindelser flød ud af enden af kromatografen. De fleste af detektorerne ødelagde forbindelserne, fordi de brændte dem eller ioniserede dem. Disse detektorer lod kemikerne gætte på den nøjagtige identitet af hver enkelt forbindelse i prøven. I 1950'erne udviklede Roland Gohlke og Fred McLafferty en ny kombineret maskine. De brugte et massespektrometer som detektor i gaskromatografien. Disse tidlige apparater var store og skrøbelige og oprindeligt begrænset til laboratoriemiljøer.

Designet var komplekst. Tidsintervallet mellem de forskellige forbindelser, der flyder ud af kromatografen, var svært at kontrollere. Massespektrometeret skulle derfor være færdig med at behandle en forbindelse, før den næste kom ud af kromatografen. I de tidlige modeller blev målingerne fra massespektrometeret registreret på millimeterpapir. Højtuddannede kemikere studerede mønstrene af toppe for at identificere hver enkelt forbindelse. I 1970'erne blev massespektrometre udstyret med analog-digital-konverteringsenheder. Dette gjorde det muligt for computere at lagre og fortolke resultaterne. Efterhånden som computerne blev hurtigere og mindre, blev GC-MS hurtigere og spredte sig fra laboratorierne til hverdagen. I dag anvendes computerstyrede GC-MS-instrumenter i vid udstrækning til miljøovervågning af vand, luft og jord. De anvendes også til regulering af landbruget, fødevaresikkerhed og til opdagelse og produktion af medicin.

Udviklingen af små computere har bidraget til at forenkle GC-MS-maskinerne. Det har også reduceret den tid, det tager at analysere en prøve, betydeligt. Electronic Associates, Inc. (EAI) var en førende amerikansk leverandør af analoge computere. I 1964 påbegyndte EAI udviklingen af et computerstyret massespektrometer under ledelse af Robert E. Finnigan. I 1966 var der solgt over 500 gasanalysatorinstrumenter. I 1967 blev Finnigan Instrument Corporation (FIC) dannet. I begyndelsen af 1968 leverede man den første prototype af kvadrapolede GC-MS-instrumenter til Stanford og Purdue University. FIC blev senere omdøbt til Finnigan Corporation og fortsatte med at etablere sig som verdens førende virksomhed inden for GC-MS-systemer.

Grundlæggende drift

GC-MS kan finde alle de forbindelser, der er blandet sammen i et prøveobjekt. Operatøren opløser prøven i en væske. Operatøren injicerer derefter væsken i en gasstrøm. (Helium, brint eller kvælstofgas anvendes oftest.) Gassen strømmer gennem et rør med en særlig belægning. Da hver forbindelse i prøven klæber til belægningen på en anden måde, kommer hver forbindelse ud af røret på et andet tidspunkt. Belægningen bruges altså til at adskille hver enkelt forbindelse, der var blandet sammen i prøven. Når hver forbindelse kommer ud for enden af røret, bliver den ioniseret og får en elektrisk ladning. De fleste forbindelser går fra hinanden, når de bliver ioniseret. De forskellige stykker flyver ind under en magnet, som adskiller stykkerne på baggrund af deres vægt og ladning. En computer måler derefter alle stykkerne af hver forbindelse. Ved at sammenligne målingerne med et computerbibliotek med kendte forbindelser laver computeren en liste med navnene på alle forbindelserne i prøven. Computeren kan også fortælle, hvor meget af hver forbindelse der var i prøven.

Instrumentering

GC-MS består af to hovedkomponenter: gaskromatografen og massespektrometeret. Gaskromatografen anvender en kapillærkolonne, som afhænger af kolonnens dimensioner (længde, diameter, filmtykkelse) og fasens egenskaber (f.eks. 5% phenylpolysiloxan). Forskellen i de kemiske egenskaber mellem forskellige molekyler i en blanding vil adskille molekylerne, når prøven bevæger sig langs kolonnen. Molekylerne bruger forskellig tid (kaldet retentionstiden) på at komme ud af (eluere fra) gaskromatografen. Dette gør det muligt for massespektrometeret nedstrøms at opfange, ionisere, accelerere, afbøje og detektere de ioniserede molekyler separat. Massespektrometeret gør dette ved at opdele hvert molekyle i ioniserede fragmenter og detektere disse fragmenter ved hjælp af deres masse-ladningsforhold.

Disse to maskiner, der anvendes sammen, giver en langt mere præcis identifikation af stoffer end hver enhed for sig. Det er ikke muligt at foretage en nøjagtig identifikation af et bestemt molekyle ved hjælp af gaskromatografi eller massespektrometri alene. Massespektrometriprocessen kræver normalt en meget ren prøve. Tidligere blev der ved gaskromatografi anvendt andre detektorer som f.eks. en flammeioniseringsdetektor. Disse detektorer kan ikke adskille forskellige molekyler, der tilfældigvis tager lige lang tid om at bevæge sig gennem kolonnen. (Når to forskellige molekyler har samme retentionstid, siges de at "co-elutere"). De co-eluterende molekyler vil forvirre de computerprogrammer, der aflæser et enkelt massespektrum for begge molekyler.

Nogle gange kan to forskellige molekyler også have et lignende mønster af ioniserede fragmenter i et massespektrometer (massespektrum). Ved at kombinere de to processer reduceres muligheden for fejl. Det er yderst usandsynligt, at to forskellige molekyler opfører sig ens i både en gaskromatograf og et massespektrometer. Hvis et massespektrum matcher den pågældende analysand, kan spektrets retentionstid derfor kontrolleres i forhold til en karakteristisk GC-retentionstid for at øge sikkerheden for, at analysanden er i prøven.

Typer af massespektrometerdetektorer

Den mest almindelige type MS, der er forbundet med en GC, er et quadrupolmassespektrometer. Hewlett-Packard (nu Agilent) markedsfører den under handelsnavnet "Mass Selective Detector" (MSD). En anden relativt almindelig detektor er ionfælde-massespektrometeret. Desuden kan man finde et massespektrometer med magnetisk sektor. Disse instrumenter er imidlertid dyre og voluminøse og findes typisk ikke i laboratorier med høj kapacitet. Der anvendes andre detektorer som f.eks. time of flight (TOF), tandem-quadrupoler (MS-MS) (se nedenfor) eller i tilfælde af en ionfælde-MSⁿ. n angiver antallet af massespektrometrietrin.

GC-MS'ets indre med gaskromatografens kolonne i ovnen til højre.


GC-MS-skematisk oversigt

Analyse

Et massespektrometer anvendes typisk på en af to måder: Fuld scanning eller selektiv ionovervågning (SIM). Den typiske GC-MS kan fungere på begge måder alene eller begge på samme tid.

Fuld scanning MS

Ved indsamling af data i fuld scanningstilstand vælges et målområde af massefragmenter og indsættes i instrumentets metode. Et eksempel på et typisk bredt område af massefragmenter, der skal overvåges, er m/z 50 til m/z 400. Fastlæggelsen af, hvilket interval der skal anvendes, afhænger i høj grad af, hvad man forventer at finde i prøven, samtidig med at man er opmærksom på opløsningsmidlet og andre mulige interferenser. Hvis en MS søger efter massefragmenter med en meget lav m/z, kan den opdage luft eller andre mulige interfererende faktorer. Hvis der anvendes et stort scanningsområde, mindskes instrumentets følsomhed. Maskinen vil udføre færre scanninger pr. sekund, fordi hver scanning vil tage længere tid at detektere et bredere spektrum af massefragmenter.

Fuld scanning er nyttig til at bestemme ukendte forbindelser i en prøve. Den giver flere oplysninger end SIM, når det drejer sig om at bekræfte eller opløse forbindelser i en prøve. De fleste instrumenter styres af en computer, som anvender et computerprogram, der kaldes en "instrumentmetode". Instrumentmetoden styrer temperaturen i GC'en, MS-scanningshastigheden og intervallet af fragmentstørrelser, der detekteres. Når en kemiker er ved at udvikle en instrumentmetode, sender han testopløsninger gennem GS-MS i fuld scanningstilstand. Herved kontrolleres GC-retentionstiden og massefragment-fingeraftrykket, inden der overgår til en SIM-instrumentmetode. Specialiserede GC-MS-instrumenter, f.eks. sprængstofdetektorer, har en instrumentmetode forudindlæst på fabrikken.

Overvågning af udvalgte ioner

I SIM (selected ion monitoring) fokuserer instrumentmetoden på visse ionfragmenter. Kun disse massefragmenter detekteres af massespektrometeret. Fordelene ved SIM er, at detektionsgrænsen er lavere, da instrumentet kun ser på et lille antal fragmenter (f.eks. tre fragmenter) ved hver scanning. Der kan foretages flere scanninger pr. sekund. Da der kun overvåges få massefragmenter af interesse, er matrixinterferenserne typisk mindre. For at forbedre chancerne for at aflæse et positivt resultat korrekt, skal ionforholdet for de forskellige massefragmenter være sammenlignelige med en kendt referencestandard.

Typer af ionisering

Når molekylerne har tilbagelagt kolonnen, passerer gennem overføringslinjen og kommer ind i massespektrometeret, ioniseres de ved forskellige metoder. Typisk anvendes der kun én ioniseringsmetode til enhver tid. Når prøven er fragmenteret, vil den blive detekteret, normalt af en elektronmultiplikatordiode. Dioden behandler det ioniserede massefragment som et elektrisk signal, der derefter registreres.

Kemikere vælger en ioniseringsteknik separat fra valg af Full Scan- eller SIM-overvågning.

Ionisering af elektroner

Den mest almindelige type ionisering er elektronionisering (EI). Molekylerne kommer ind i MS'en (kilden er en quadrupol eller selve ionfælden i en ionfælde MS), hvor de rammes af frie elektroner, der udsendes fra en glødetråd. Dette er ligesom den glødetråd, man finder i en almindelig glødepære. Elektronerne rammer molekylerne, hvilket får molekylet til at fragmentere på en karakteristisk måde, som kan gentages. Denne "hårde ioniseringsteknik" resulterer i, at der dannes flere fragmenter med lavt masse/ladningsforhold (m/z). EI har kun få eller ingen fragmenter med en masse, der ligger tæt på det oprindelige molekyls masse. Kemikere anser hård ionisering for at være at skyde elektroner ind i prøvemolekylerne. I modsætning hertil er "blød ionisering" at placere en ladning på prøvemolekylet ved at ramme det med en introduceret gas. Det molekylære fragmenteringsmønster afhænger af den elektronenergi, der påføres systemet, typisk 70 eV (elektronvolt). Brugen af 70 eV gør det lettere at sammenligne de spektrer, der genereres fra prøveprøven, med kendte biblioteksspektrer. (Biblioteksspektre kan stamme fra software leveret af producenten eller software udviklet af National Institute of Standards (NIST-USA)). Softwaren søger i biblioteksspektre ved hjælp af en matchningsalgoritme som f.eks. sandsynlighedsbaseret matchning eller dot-product matching. Mange standardiseringsorganer for metoder kontrollerer nu disse algoritmer og metoder for at sikre deres objektivitet.

Kemisk ionisering

Ved kemisk ionisering (CI) tilføres en reagensgas, typisk metan eller ammoniak, til massespektrometeret. Der findes to typer CI: positiv CI og negativ CI. Uanset hvad der sker, vil reagensgassen interagere med elektronerne og analysanden og forårsage en "blød" ionisering af det pågældende molekyle. En blødere ionisering fragmenterer molekylet i mindre grad end den hårde ionisering ved EI. Kemikere foretrækker CI frem for EI. Det skyldes, at CI producerer mindst ét massefragment med en vægt, der næsten svarer til molekylvægten af den pågældende analysand.

Positiv kemisk ionisering

Ved positiv kemisk ionisering (PCI) interagerer reagensgassen med målmolekylet, oftest med en protonudveksling. Herved produceres ionarten i relativt store mængder.

Negativ kemisk ionisering

Ved negativ kemisk ionisering (NCI) mindsker reagensgassen de frie elektroners indvirkning på målanalysen. Denne formindskede energi efterlader typisk fragmentet i stor udstrækning. (Fragmenterne opsplittes ikke yderligere).

Fortolkning

Det primære mål med instrumentanalyse er at måle en stofmængde. Dette gøres ved at sammenligne de relative koncentrationer mellem de atomare masser i det genererede massespektrum. Der er to slags analyser mulige, sammenlignende og originale analyser. Ved sammenlignende analyse sammenlignes det givne spektrum med et spektrumbibliotek for at se, om dets karakteristika er til stede for en kendt prøve i biblioteket. Dette udføres bedst af en computer, da der kan forekomme mange visuelle forvrængninger på grund af skalavariationer. Computere kan også korrelere flere data (f.eks. de retentionstider, der er identificeret af GC'en), så visse data kan relateres mere nøjagtigt.

En anden analysemetode måler toppene i forhold til hinanden. Ved denne metode sættes den højeste top til 100 %. De andre toppe får en værdi svarende til forholdet mellem tophøjden og den højeste tophøjde. Alle værdier over 3% tildeles. Den ukendte forbindelses samlede masse angives normalt af den overordnede top. Værdien af denne hovedtop kan bruges til at passe med en kemisk formel, der indeholder de forskellige grundstoffer, som man mener, at forbindelsen indeholder. Isotopmønsteret i spektret er unikt for grundstoffer, der har mange isotoper. Det kan derfor også bruges til at identificere de forskellige grundstoffer, der er til stede. Dette fortæller den overordnede kemiske formel for det ukendte molekyle. Fordi et molekyls struktur og bindinger går fra hinanden på karakteristiske måder, kan de identificeres ud fra forskellen i topmasser. Den identificerede molekylstruktur skal stemme overens med de egenskaber, der registreres af GC-MS. Typisk foretages denne identifikation automatisk af de computerprogrammer, der følger med instrumentet. Disse programmer sammenligner spektrene med et bibliotek af kendte forbindelser, som har samme liste over de elementer, der kan være til stede i prøven.

En "fuld spektrum"-analyse tager hensyn til alle "toppe" i et spektrum. Men selektiv ionovervågning (SIM) overvåger kun udvalgte toppe, der er forbundet med et bestemt stof. Kemikere antager, at et sæt ioner ved en given retentionstid er karakteristisk for et bestemt stof. SIM er en hurtig og effektiv analyse. SIM fungerer bedst, når analytikeren har tidligere oplysninger om en prøve eller kun leder efter nogle få specifikke stoffer. Når mængden af indsamlede oplysninger om ionerne i et gaskromatografisk peak mindskes, øges analysens følsomhed. SIM-analysen gør det således muligt at detektere og måle en mindre mængde af et stof. Men graden af sikkerhed med hensyn til identiteten af denne forbindelse reduceres.

GC-tandem MS

Når der tilføjes en anden fase af massefragmentering, f.eks. ved hjælp af en anden quadrupol i et quadrupolinstrument, kaldes det tandem MS (MS/MS). MS/MS er gode til at måle lave niveauer af målforbindelser i en prøve med en matrix af baggrundsforbindelser, som ikke er af interesse.

Den første quadrupol (Q1) er forbundet med en kollisionscelle (q2) og en anden quadrupol (Q3). Begge quadrupoler kan anvendes i scanning eller statisk tilstand, afhængigt af den anvendte MS/MS-analyse. Analysetyperne omfatter produkt-ion-scanning, prækursor-ion-scanning, Selected Reaction Monitoring (SRM) og Neutral Loss Scan. F.eks: Når Q1 er i statisk tilstand (hvor der kun ses på én masse som i SIM), og Q3 er i scanningstilstand, får man et såkaldt produktionspektrum (også kaldet "datterspektrum"). Fra dette spektrum kan man vælge en fremtrædende produktion, som kan være produktjonen for den valgte forløberion. Dette par kaldes en "overgang" og danner grundlaget for SRM. SRM er meget specifik og eliminerer næsten fuldstændigt matrixbaggrund.

Applikationer

Miljøovervågning og oprensning

Mange kemikere mener, at GC-MS er det bedste værktøj til overvågning af organiske forurenende stoffer i miljøet. Omkostningerne ved GC-MS-udstyr er faldet meget. GC-MS' pålidelighed er samtidig steget. Begge forbedringer har øget anvendelsen i miljøundersøgelser. Nogle forbindelser, f.eks. visse pesticider og herbicider, kan ikke identificeres ved hjælp af GS-MS. De ligner for meget andre beslægtede forbindelser. Men til de fleste organiske analyser af miljøprøver, herunder mange større klasser af pesticider, er GC-MS meget følsom og effektiv.

Kriminaltekniske undersøgelser

GC-MS kan analysere partikler fra et menneskeligt legeme for at hjælpe med at knytte en forbryder til en forbrydelse. Loven accepterer, at GC-MS anvendes til at analysere brandrester. Faktisk har American Society for Testing Materials (ASTM) en standard for analyse af brandrester. GCMS/MS er særlig nyttig her, da prøverne ofte indeholder meget komplekse matricer, og resultaterne, der anvendes i retten, skal være meget nøjagtige.

Retshåndhævelse

GC-MS anvendes til påvisning af ulovlige stoffer og kan på sigt erstatte narkohunde. Den anvendes også ofte i retsmedicinsk toksikologi. Den hjælper med at finde narkotika og/eller giftstoffer i biologiske prøver fra mistænkte, ofre eller et lig.

Sikkerhed

Efter terrorangrebene den 11. september 2001 er sprængstofdetektionssystemer blevet en del af alle amerikanske lufthavne. Disse systemer er baseret på en lang række teknologier, hvoraf mange er baseret på GC-MS. Der er kun tre producenter, der er certificeret af FAA til at levere disse systemer. Den første er Thermo Detection (tidligere Thermedics), som fremstiller EGIS, en GC-MS-baseret serie af sprængstofdetektorer. Den anden er Barringer Technologies, som nu ejes af Smith's Detection Systems. Den tredje er Ion Track Instruments (en del af General Electric Infrastructure Security Systems).

Analyse af fødevarer, drikkevarer og parfume

Fødevarer og drikkevarer indeholder en masse aromatiske forbindelser, hvoraf nogle er naturligt til stede i råvarerne og andre dannes under forarbejdningen. GC-MS anvendes i vid udstrækning til analyse af disse forbindelser, som omfatter estere, fedtsyrer, alkoholer, aldehyder, terpener osv. Den anvendes også til at påvise og måle forurenende stoffer fra fordærv eller forfalskning, som kan være skadelige. Forurenende stoffer kontrolleres ofte af statslige myndigheder, f.eks. pesticider.

Astrokemi

Flere GC-MS har forladt jorden. To blev sendt til Mars i Viking-programmet. Venera 11 og 12 og Pioneer Venus analyserede Venus' atmosfære med GC-MS. Huygens-sonden fra Cassini-Huygens-missionen landede en GC-MS på Saturns største måne, Titan. Materialet i kometen 67P/Churyumov-Gerasimenko vil blive analyseret af Rosetta-missionen med et chiralt GC-MS i 2014.

Medicin

GC-MS anvendes i screeningtest for nyfødte. Disse test kan finde snesevis af medfødte stofskiftesygdomme (også kendt som medfødte stofskiftefejl). GC-MS kan bestemme forbindelser i urinen selv i meget små mængder. Disse forbindelser er normalt ikke til stede, men forekommer hos personer, der lider af stofskifteforstyrrelser. Dette er ved at blive en almindelig metode til at diagnosticere IEM med henblik på tidligere diagnosticering og påbegyndelse af behandling. Dette fører i sidste ende til et bedre resultat. Det er nu muligt at teste en nyfødt for over 100 genetiske stofskiftesygdomme ved hjælp af en urinprøve ved fødslen baseret på GC-MS.

I kombination med isotopmærkning af metaboliske forbindelser anvendes GC-MS til at bestemme metabolisk aktivitet. De fleste anvendelser er baseret på anvendelse af ¹³C som mærkning og måling af ¹³C- ¹²C-forholdet med et isotopforholdsmassespektrometer (IRMS). Et IRMS er et massespektrometer med en detektor, der er beregnet til at måle nogle få udvalgte ioner og returnere værdierne som forhold.