Styret evolution
Directed evolution (DE) er en metode, der anvendes til at fremstille enzymer til industrielle eller medicinske formål.
Metoden er proteinteknik, som efterligner naturlig udvælgelse.
Den grundlæggende idé er at udsætte et gen for gentagne mutationer for at skabe et bibliotek af varianter. Udvælgelse isolerer gener med den ønskede funktion. De er en skabelon for den næste runde.
Dette kan gøres in vivo (i levende celler af bakterier eller gær) eller in vitro (frit i opløsning eller mikrodråber).
Ved at teste flere mutanter øges chancerne for at finde en med de ønskede egenskaber.
Under in vivo-evolutionen transformeres hver celle (normalt bakterier eller gær) med et plasmid, der indeholder et andet medlem af variantbiblioteket. Kun det pågældende gen er forskelligt fra celle til celle, mens alle andre gener forbliver de samme.
Cellerne udtrykker proteinet enten i cytoplasmaet eller i overfladen, hvor dets funktion kan testes. Dette format har den fordel, at der kan udvælges egenskaber i et cellulært miljø, hvilket er nyttigt, når det udviklede protein eller RNA skal anvendes i levende organismer.
Når DE udføres uden celler, anvendes in vitro-transskription og translation til at producere proteiner eller RNA frit i opløsning eller i kunstige mikrodråber. Dette har den fordel, at der er flere betingelser (f.eks. temperatur, opløsningsmidler). Det kan udtrykke proteiner, som ville være giftige for celler. Desuden kan in vitro evolutionseksperimenter generere langt større biblioteker (op til 10 15), fordi biblioteks-DNA'et ikke behøver at blive indsat i cellerne. Det begrænser ofte, hvad der kan gøres.
Et eksempel på styret evolution sammenlignet med den naturlige evolution. Den indre cyklus viser de tre faser i den styrede udviklingscyklus med den efterlignede naturlige proces i parentes. Den yderste cirkel viser trinene i et typisk eksperiment. De røde symboler angiver funktionelle varianter, de lyse symboler angiver varianter med reduceret funktion
Sikring af arvelighed
Når funktionelle proteiner er blevet isoleret, er det nødvendigt, at deres gener også er det, og derfor er der behov for en genotype-fænotype-forbindelse.
Dette kan være kovalent, hvor mRNA-genet er forbundet til proteinet ved slutningen af translationen med puromycin.
Alternativt kan proteinet og dets gen opbevares sammen eller i emulsionsdråber. De isolerede gensekvenser formeres derefter ved PCR eller ved hjælp af transformerede værtsbakterier. Enten den bedste enkeltsekvens eller en pulje af sekvenser kan anvendes som skabelon for den næste mutageneserunde. De gentagne cyklusser af diversificering-selektion-amplifikation skaber enzymvariationer, der er tilpasset selektionsprocessen.
Et udtrykt protein kan være kovalent knyttet til sit gen (som i mRNA), til venstre, eller anbringes i samme rum som det, til højre. I begge tilfælde er det gen, der koder for proteinet, isoleret.
Tildelt pris
Den amerikanske ingeniør Frances Arnold har vundet Millennium Technology Prize for sin pionerindsats inden for styret evolution.
Spørgsmål og svar
Q: Hvad er rettet udvikling?
A: Directed evolution (DE) er en metode, der anvendes til at fremstille enzymer til industrielle eller medicinske formål. Det er en form for proteinteknik, som efterligner naturlig udvælgelse.
Q: Hvordan virker rettet evolution?
A: Directed evolution fungerer ved at lade et gen gennemgå gentagne mutationsrunder, hvorved der skabes et bibliotek af varianter. Udvælgelse isolerer derefter gener med den ønskede funktion, som derefter bruges som skabeloner til den næste runde.
Spørgsmål: Hvor kan man foretage rettet evolution?
Svar: Styret evolution kan foregå in vivo (i levende celler af bakterier eller gær) eller in vitro (frit i opløsning eller mikrodråber).
Spørgsmål: Hvad er fordelene ved at foretage rettet evolution in vivo?
Svar: Ved at foretage rettet evolution in vivo kan man udvælge egenskaber i et cellulært miljø, hvilket er nyttigt, når det udviklede protein eller RNA skal anvendes i levende organismer.
Spørgsmål: Hvilke fordele er der ved at foretage rettet evolution in vitro?
Svar: Ved at foretage rettet evolution in vitro er det en fordel at tillade flere betingelser (f.eks. temperatur, opløsningsmidler), og der kan udtrykkes proteiner, som ville være giftige for celler. Desuden kan man generere langt større biblioteker, fordi det ikke er nødvendigt at indsætte DNA i cellerne.
Spørgsmål: Hvad begrænser, hvad der kan gøres under et in vitro-forsøg?
Svar: Størrelsesgrænsen for, hvad der kan gøres under et in vitro-forsøg, er ofte bestemt af, hvor meget DNA der skal indsættes i cellerne.
