Genetisk transformation: Hvordan celler optager og udtrykker fremmed DNA
Opdag genetisk transformation: hvordan celler optager og udtrykker fremmed DNA, naturligt eller kunstigt, og dens rolle i forskning og bioteknologi.
I molekylærbiologi er transformation den genetiske ændring af en celle ved direkte optagelse og ekspression af DNA fra dens omgivelser.
Transformation sker naturligt i nogle bakteriearter og kan også ske kunstigt. Bakterier, der er i stand til at blive transformeret, enten naturligt eller kunstigt, kaldes kompetente bakterier.
Transformation er en af tre processer, hvorved genetisk materiale udefra kan komme ind i bakterieceller. De to andre er konjugation (overførsel af genetisk materiale mellem to bakterieceller i direkte kontakt) og transduktion (indsprøjtning af fremmed DNA med en bakteriofag i værten).
Transformation kan også bruges til at beskrive indsættelse af nyt genetisk materiale i ikke-bakterielle celler, f.eks. dyre- og planteceller. Introduktion af fremmed DNA i eukaryote celler kaldes normalt "transfektion".
Naturlig vs. kunstig transformation
Naturlig transformation forekommer i visse bakteriearter, når de er i en særlig fysiologisk tilstand kaldet kompetence. I denne tilstand udtrykker cellerne et sæt proteiner, der binder og transporterer frit DNA over cellevæggen og/eller membranen. Eksempler på naturligt kompetente bakterier er Streptococcus-, Bacillus-, Neisseria- og Haemophilus-arter.
Kunstig transformation fremkaldes i laboratoriet for at få celler til at optage fremmed DNA. Hyppigt anvendte metoder omfatter:
- Kemisk kompetibilisering (f.eks. CaCl2 + heat shock) – en simpel metode til plasmidoptagelse i E. coli.
- Elektroporation – kraftige elektriske pulser for at skabe midlertidige porer i cellemembranen; effektiv til både bakterier og eukaryote celler.
- Fysisk levering – f.eks. mikroinjektion eller biolistisk (“gene gun”) metode til planteceller og visse dyreceller.
- Vektorbaserede metoder – vira (viral vektorer) bruges ofte til at indføre DNA i eukaryote celler, især i cellelinjer og i genterapiforskning.
Mekanisme for optagelse og udtryk
Ved naturlig transformation binder DNA sig ofte først til overfladen via DNA-bindende proteiner eller pili. Enzymer kan nedbryde den ene streng, så kun enkeltstrenget DNA trækkes ind, hvilket letter homolog rekombination med kromosomet. I kunstige metoder træder fremgangsmåden anderledes i kraft: plasmider, der allerede er cirkulære og replikationskompetente, kan efter optagelse replikere og udtrykke gener uafhængigt af kromosomet.
Efter optagelse kan det fremmede DNA:
- forblive episomalt (fx plasmid) og replikere uafhængigt, eller
- integreres i værtsgenomet via homolog rekombination eller transposon-medierede mekanismer.
Typisk laboratorieproces
En almindelig arbejdsrekke for bakteriel transformation ser sådan ud:
- Forberedelse af kompetente celler (kemisk eller ved elektrokompetibilisering).
- Blanding af kompetente celler med plasmid- eller stykke-DNA.
- Induktion af DNA-optagelse (heat shock eller elektrisk puls).
- Kort gendannelsesperiode i næringsmedium for at lade cellerne udtrykke selektionsmarkører.
- Plating på selektivt medium (fx antibiotika) for at isolere transformanter.
Validering af succes kan ske ved kolonipluk og analyse som plasmid-ekstraktion, restriktionsanalyse eller sekventering.
Anvendelser
- Rekombinant proteinproduktion – indsættelse af genkloner i værtsceller for at producere proteiner (fx insulin, enzymer).
- Genterapi og forskning i cellebiologi – ændring af eukaryote celler ved transfektion eller virale vektorer.
- Genetisk kortlægning og knockout-studier – introduktion af mærkede eller forstyrrede gener for funktionelle studier.
- Bioteknologisk udvikling – konstruktion af genetisk modificerede organismer (GMO) til landbrug, industri eller miljøanvendelser.
Begrænsninger, sikkerhed og gode råd
Transformation har tekniske og biologiske begrænsninger: ikke alle celler er let transformerbare, store DNA-konstruktioner har lavere effektivitet, og værtsbegrænsende systemer som restriktions-modyfikationssystemer kan nedbryde fremmed DNA.
Vigtige sikkerheds- og etiske overvejelser:
- Anvend altid passende biosikkerhedsniveau og laboratorieprocedurer for at undgå uautoriseret spredning af manipulerede mikroorganismer.
- Vær bevidst om konsekvenser ved at arbejde med antibiotikaresistensmarkører og GMO’er; anvend om muligt afmærkede og godkendte markører eller alternative selektionsmetoder.
- Følg lokale regler for genterapi og frigivelse af genetisk modificerede organismer.
Praktiske tips for højere transformationsresultater: brug høj renhed af DNA, optimer mængden af DNA til hver behandling, hold celler kolde før heat shock (ved kemisk metode), giv tilstrækkelig gendannelsestid efter behandling før selektion, og brug passende positive kontrolprøver (kendt plasmid og kompetente celler).
Opsummering
Transformation er et centralt værktøj i moderne molekylærbiologi, der tillader indførsel og udtryk af fremmed DNA i både prokaryote og eukaryote celler. Metoden findes i naturen, men udnyttes og modificeres i laboratoriet gennem flere teknikker med brede anvendelser inden for forskning, medicin og bioteknologi. For succes kræves forståelse af den valgte metode, værtscellens biologi og omhyggelig opmærksomhed på biosikkerhed og etik.
Historie
Transformation blev først demonstreret i 1928 af den britiske bakteriolog Frederick Griffith. Griffith opdagede, at en harmløs stamme af Streptococcus pneumoniae kunne gøres virulent efter at være blevet udsat for varmedræbte virulente stammer.
Griffith mente, at et "transformerende princip" fra den varmedræbte stamme var ansvarlig for at gøre den harmløse stamme virulent. I 1944 identificerede Oswald Avery, Colin MacLeod og Maclyn McCarty dette omdannende princip som værende genetisk. De isolerede DNA fra en virulent stamme af S. pneumoniae og kunne ved hjælp af netop dette DNA gøre en uskadelig stamme virulent. De kaldte denne optagelse og inkorporering af DNA i bakterier for "transformation". Se Avery-MacLeod-McCarty-forsøget.
Resultaterne af disse eksperimenter blev i første omgang modtaget med skepsis af det videnskabelige samfund. Først da Joshua Lederberg opdagede andre metoder til genetisk overførsel (konjugation i 1947 og transduktion i 1953), blev Averys eksperimenter accepteret. Transformation blev først en rutineprocedure i laboratorierne i 1972, da Cohen med succes transformerede Escherichia coli ved at behandle bakterierne med calciumchlorid. Dette skabte en effektiv og bekvem procedure til at transformere bakterier og banede vejen for bioteknologi og forskning.
Transformation af dyre- og planteceller blev også undersøgt, og den første transgene mus blev skabt ved at injicere et gen for et væksthormon fra rotter i et museembryo i 1982.
I 1907 opdagede man en bakterie, Agrobacterium tumefaciens, der forårsagede plantetumorer, og i begyndelsen af 1970'erne fandt man ud af, at det tumorinducerende middel var et DNA-plasmid kaldet Ti-plasmidet. Ved at fjerne de gener i plasmidet, der forårsagede tumoren, og tilføje nye gener kunne forskerne inficere planter med A. tumefaciens og lade bakterierne indsætte deres valgte DNA i planternes genomer.
Ikke alle planteceller er modtagelige for infektion med A. tumefaciens, så der blev udviklet andre metoder, herunder elektroporation og mikroinjektion. Partikelbombardement blev muliggjort med opfindelsen af Biolistic Particle Delivery System (genkanon) af John Sanford i 1990.
Spørgsmål og svar
Q: Hvad er transformation inden for molekylærbiologi?
A: Transformation er processen med genetisk ændring af en celle ved direkte optagelse og udtryk af DNA fra dens omgivelser.
Q: I hvilke arter af bakterier forekommer transformation naturligt?
A: Transformation forekommer naturligt i nogle bakteriearter.
Q: Hvad er betegnelsen for bakterier, der er i stand til at blive transformeret?
A: Bakterier, der er i stand til at blive transformeret, kaldes kompetente.
Q: Hvad er de to andre processer, hvormed genetisk materiale udefra kan bringes ind i bakterieceller, udover transformation?
A: De to andre processer, hvormed genetisk materiale udefra kan bringes ind i bakterieceller, er konjugation og transduktion.
Q: Kan transformation udføres kunstigt?
A: Ja, transformation kan også udføres kunstigt.
Q: Hvad er definitionen på transfektion?
A: Transfektion er processen med at introducere nyt genetisk materiale i ikke-bakterielle celler, såsom dyre- og planteceller.
Q: Hvordan adskiller transduktion sig fra transformation?
A: Transduktion involverer indsprøjtning af fremmed DNA med en bakteriofag i værten, mens transformation involverer direkte optagelse og udtryk af DNA fra omgivelserne.
Søge