Fluorescensmikroskop – definition, principper og anvendelser

Lær om fluorescensmikroskopets definition, arbejdsprincipper og anvendelser i biovidenskab — fra epifluorescens-opstilling til billeddannelse og detektion.

Et fluorescensmikroskop er et optisk mikroskop, der bruger fluorescens og fosforescens til at undersøge organiske eller uorganiske stoffer. "Fluorescensmikroskop": ethvert mikroskop, der anvender fluorescens til at lave et billede. Dette gælder, uanset om det er en mere simpel opsætning eller en mere kompliceret konstruktion.

Principper for fluorescensmikroskopi

Grundideen i fluorescensmikroskopi er, at et molekyle (en fluorofor) absorberer lys ved én bølgelængde (excitation) og udsender lys ved en længere bølgelængde (emission). I et typisk opbygget fluorescensmikroskop ledes excitationslyset via objektivet ned på prøven, og det udsendte fluorescerende lys samles og filtreres, så det kan afbildes af okularet eller en detektor.

Vigtige komponenter:

• Lysskilde: traditionelle kviksølv- eller xenonlamper, moderne LED'er eller lasere afhængig af krav til spektrum og intensitet.
• Excitations- og emissionsfiltre: selekterer passende bølgelængder, så kun excitationslys når prøven, og kun emissionslys når detektoren.
• Dichroisk stråleskiller: et bølgelængdespecifikt spejl, som reflekterer excitationslys mod prøven og transmitterer emissionslys til detektoren.
• Objektiver med høj numerisk apertur (NA): afgørende for lysindsamling og opløsning.
• Detektorer: øje/okular, CCD/CMOS-kameraer eller fotomultiplikatorer (PMT) afhængig af følsomhedskrav.

Epifluorescens-opstilling

De fleste fluorescensmikroskoper inden for biovidenskab er af epifluorescenstypen: lyset belyser prøven gennem objektivet, og det fluorescerede lys indsamles af samme objektiv. Den dichroiske stråleskiller sørger for, at det fluorescerede lys ledes videre til okularet eller kameraet, mens størstedelen af excitationslyset tilbagekastes til kilden.

Prøvepræparation og fluoroforer

For at visualisere strukturer mærkes prøven med fluoroforer — enten kemiske farvestoffer (f.eks. FITC, Alexa-fluor), fluorescerende proteiner (f.eks. GFP og varianter) eller via fluorescerende antistoffer i immunofluorescens. Prøvebehandling kan omfatte fiksering, permeabilisering og montering i anti-fade medier for at reducere photobleaching (fotokemisk nedbrydning af fluoroforer).

Typer af fluorescensmikroskoper

• Bredfelt/epifluorescens: standardopsætning til mange rutineanalyser og billeddannelse af faste prøver.
• Konfokal mikroskopi: bruger en pinhole til at fjerne ude af fokus lys og giver optiske snit, bedre kontrast og mulighed for 3D-rekonstruktion.
• Spinning disk konfokal: hurtigere konfokal billeddannelse velegnet til live-cell imaging.
• TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence): belyser kun et tyndt lag nær dækglasset og er ideel til membran- eller overfladeprocesser.
• Superopløsningsmetoder: teknikker som STED, PALM og STORM bryder diffraktionsgrænsen og giver opløsning langt under 200 nm.

Anvendelser

• Cellbiologi: lokalisering af proteiner, organeller, cellecyklusstudier, visualisering af signaltransduktionsveje.
• Immunofluorescens og histologi: påvisning af antigener i vævssnit og celler.
• Genetik: FISH (fluorescens in situ hybridisering) til kromosomanalyse.
• Live-cell imaging: sporing af cellebevægelser, vesikeltransport og calcium-dynamik.
• Materiale- og nanovidenskab: karakterisering af fluorescerende materialer, lækageanalyser og overfladeundersøgelser.
• Klinisk diagnostik og mikrobiologi: patogendetektion, blodprøver og tumor-marker-analyser.

Fordele og begrænsninger

Fordele: høj kontrast, mulighed for multiplexing (flere farver samtidig), følsom detektion af specifikke molekyler og velegnet til både faste og levende prøver.

Begrænsninger: fotobleaching og fototoksicitet ved langvarig belysning, autofluorescens fra prøvemateriale kan give baggrundsstøj, spektral overlap mellem fluoroforer kræver korrekt filter- og farvekompensation, og den optiske opløsning er begrænset af diffraktion med mindre superopløsningsmetoder anvendes.

Praktiske råd og sikkerhed

• Brug passende filter- og excitationskombinationer til valgte fluoroforer for at minimere spektral krydstale.
• Reducer fotobleaching ved at bruge lavest muligt lysintensitet og anti-fade montering.
• Kalibrer og vedligehold udstyret: rengør objektiver, tjek alignering af lysbane og udskift slidte lamper.
• Følg lasersikkerhedsprocedurer hvis lasersystemer anvendes, samt øjenbeskyttelse ved kraftige UV-/synlige lyskilder.

Fluorescensmikroskopi er et fleksibelt og kraftfuldt værktøj inden for både forskning og diagnostik. Valg af korrekt mikroskoptype, fluoroforer og prøveforberedelse er afgørende for at få pålidelige og meningsfulde resultater.

Spørgsmål og svar

Q: Hvad er et fluorescensmikroskop?

Q: Hvad betyder udtrykket "fluorescensmikroskop"?

Spørgsmål: Hvordan er de fleste fluorescensmikroskoper, der anvendes inden for biovidenskab, udformet?

Spørgsmål: Hvordan belyser et fluorescensmikroskop prøven?

Sp: Hvordan registrerer et fluorescensmikroskop den fluorescens, der udsendes af prøven?

Sp: Hvilken funktion har den dichroiske stråleskiller i et fluorescensmikroskop?

Spørgsmål: Hvad er forskellen mellem fluorescens og fosforescens?

Søg efter bogstav